流感病毒快速检测方法特异性和敏感性研究

发布时间:2015/2/10 13:07:50

流感病毒快速检测方法特异性和敏感性研究

尤凤兴1 , 居丽雯2 , 张敬平1 , 施 强2 , 马广源1 , 吉杏生1 , 吴家林1 , 凌 霞1

(1. 无锡市疾病预防控制中心江苏无锡214023; 2. 复旦大学公共卫生学院上海200032)

 

   摘要:目的 比较多重逆转录聚合酶链反应(mRT2PCR)和胶体金法检测流感病毒的敏感性和特异性。方法采用mRT2PCR和胶体金法检测经细胞培养和红细胞凝集抑制试验(H I)鉴定为A /H1、A /H3、B型流感病毒的鼻咽拭标本78,阴性鼻咽拭标本40,并对已稀释成101 105病毒半数感染量( TCID50) /0. 1 mL3H1、H3、B型流感病毒进行敏感性试验。结果 mRT2PCRA型流感病毒的检测敏感性为44. 8% ,特异性为97. 5%;B型流感病毒检测敏感性为20. 0% ,特异性为100. 0%。胶体金法对A型流感病毒检测敏感性为

44. 8% ,特异性为100. 0%;型流感病毒检测敏感性为5. 0% ,特异性为97. 5%。对经20 代内狗肾细胞(MDCK)分离培养阳性的4A /H1、4A /H33B型流感培养液,mRT2PCR和胶体金法检测的阳性符合率与型别符合率均为100. 0%。mRT2PCR检测流感病毒敏感性为103 TCID50 /0. 1 mL;胶体金法检测的敏感性为103 TCID50 /0. 1 mL。结论 mRT2PCR和胶体金法的敏感性与特异性无差异; mRT2PCR和胶体金法均可用于人群流感鼻咽拭标本流感病毒快速检测,特别是聚集性暴发流感患者,建议采样时标本数要适当放大23倍。mRT2PCR可进一步确定流感病毒的H1H3亚型。

关键词:流感病毒;分离;多重逆转录聚合酶链反应;胶体金法

Research on the specificity and sensitivity of rapid detection methods of influenza virus YOU Fengxing1 ,JU L iwen2 , ZHANG J ingping1 , SHI Q iang2 , MA Guangyuan1 , J I X ingsheng1 , WU J ialin1 , L ING X ia1.  ( 1. W uxiCenter forD iseases Prevention and Control, J iangsu W ux i 214023, China; 2. The College of Public Health of FudanUniversity, Shanghai 200032, China)

  Abstract: Objective  To research the sensitivity and specificity of multip lex reverse transcrip tion2polymerasechain reaction (mRT2PCR) and colloidal gold rap id test for detection of influenza virus. Methods The samp les beingidentified as influenza virus A /H1, A /H3 and B by cell culture and hemagglutination inhibition (H I) test weredetermined bymRT2PCR and colloidal gold rap id test in 78 positive samp les and 40 negative samp les of nasopharynxswabs. Additionally, the sensitivitywas determined in the samp les of influenza virus H1, H3 and B diluted from 101 to105 TCID50 /0. 1mL. Results The sensitivity of mRT2PCR to influenza virus A was 44. 8% , and its specificity toinfluenza virusA was 97. 5%. The sensitivity of mRT2PCR to influenza virus B was 20. 0% , and its specificity toinfluenza virus B was 100. 0%. The sensitivity of colloidal gold rap id test to influenza virus A was 44. 8% , and its specificity to influenza virusA was 100. 0%. The sensitivity of colloidal gold rap id test to influenza virusB was 5. 0% ,and its specificity to influenza virusB was 97. 5%. mRT2PCR and colloidal gold rap id test detected 4 samp les ofA /H1,4 samp les of A /H3 and 3 samp les of B being identified byMDCK cell culture, and the positive coincidence and typecoincidence of the two testswere 100. 0%. The sensitivity ofmRT2PCR to influenza viruswas 103 TCID50 /0. 1 mL, andthe sensitivity of colloidal gold rap id test to influenza virus was 103 TCID50 /0. 1 mL. Conclusion s There is no

statistical difference in the sensitivity and specificity of mRT2PCR and colloidal gold rap id test. Both mRT2PCR andcolloidal gold rap id test can be used in rap id detection of nasopharynx swabs samp les of influenza virus, especially in thecluster of patients with exp losive influenza virus, but the quantity of samp le should be increased 2 to 3 times in thecourse of samp ling. The tests ofmRT2PCR can identify subtype H1 and H3 of influenza virus.

Key words: Influenza virus; Isolation; Multip lex reverse transcrip tion2polymerase chain reaction; Rap id test,colloidal gold


引起流行性感冒(简称流感)的主要病毒是A、B型流感病毒,通常只有A型和B型流感病毒会引起大流行或局部的暴发流行[ 1 ] 。传统病毒分离培养和红细胞凝集抑制试验(H I)鉴定方法特异性和敏感性强,但病毒分离培养耗费时间较长,需要有流感病毒型特异性抗血清,对于人群聚集性流感暴发提供病原体诊断依据相对较慢。胶体金法出结果快速,只需20 min,操作简便,适于现场检测,但其只能鉴定AB型流感,目前还不能进行亚型鉴定,并且没有国产试剂,试剂盒价格昂贵,有文献报道敏感性相对较低[ 2 ] 。多重逆转录聚合酶链反应(mRT2PCR)检测过程需4 h,并需要一定的仪器设备,与胶体金法比较成本低,并且可以进行亚型鉴定。对于聚集性流感暴发,首先要快速出结果,并且最好能够提供型与亚型的诊断?;诖?/span>,我们对胶体金法和mRT2PCR在流感病毒的快速检测进行了较为全面的比较研究。

材料和方法

一、试验材料

1. 标本与来源 标本来自无锡市人民医院儿

童医院分部和无锡市第三人民医院儿内科国家流

感监测网络哨点医院,从就诊流感样病例及肺炎病例(体温≥38 )采集鼻咽拭子;如果局部有疑似流感暴发,由市、区疾控中心采集标本。标本采集后冷链12 h内运送至实验室, 24 h内进行流感病毒分离培养和快速检测试验。24 h内不能进行实验的咽拭标本即置70 低温冰箱保存待测。流感病毒敏感性实验标本选择由本室分离鉴定、国家流感中心确认的A /江苏北塘/122 /2008(H1 ) 、A /江苏北塘/149 /2008 (H3 ) 、B /江苏北塘/137 /2008流感病毒株。

2. 试剂 RNA提取和mRT2PCR使用宝生物

工程有限公司Takara RNAiso Plus试剂盒,批号为

DV818A。引物设计参见文献[ 3, 4 ]。H1、H3、B

扩增产物分别为431、210390 bp。胶体金法试

剂盒由杭州创新生物检控技术有限公司提供(

药准字S20050106 ) ,批号为FA080301。仪器为

美国B IO2RAD Mycycler PCR仪。

二、实验方法

1. 病毒分离培养与鉴定 采用20代内狗肾

细胞(MDCK)分离培养。标本预处理: 3 mL标本

150μL“四抗”2℃冰箱过夜。将已长成单

层的MDCK用含0. 02 mL /mL“四抗”基础培养基

2,接种150300 μ标本34 吸附

2 h吸弃标本液加培养维持液(终浓度为

5μg/mL胰酶、各50μL /mL“四抗”、0. 2%小牛血清白蛋白) ,35 、5%CO2培养箱培养, 24 h后逐日观察细胞病变, 1周后对所有的细胞培养液用0. 75%的人“O”型红细胞作微量血凝实验。血

凝阳性培养液用国家流感中心统一下发的已知亚型血清作H I,鉴定所分离流感病毒的型别。

2. 胶体金法检测 按照试剂盒说明书操作步

骤进行。

3. Takara RNAiso Plus RNA提取 按大连宝

生物Takara试剂盒提取。

4. mRT2PCR 按照Takara试剂盒说明书操作步骤进行。mRT2PCR反应体系25μL,各反应物浓度: 10 ×缓冲液2. 5μL、MgCl2 ( 25 mmol/L)2μL、种脱氧核糖核酸μL、Taq ( 5 U /μL )0. 4μL, 3 对引物各1. 25 μL、逆转录生成的cDNA 4 μL、加水至25 μL。反应程序94 3 min, 94  30 s、51  1 min、68  1 min,35个循环68  10 min。结果判断: H1 431 bp, H3210 bp,B 390 bp。

5. 病毒半数感染量( TCID50)测定 用A /江苏北塘/122 /2008 (H1 ) 、A /江苏北塘/149 /2008(H3) 、B /江苏北塘/137 /2008已知阳性标本进行10- 1 10- 7稀释,在已长成单层细胞的96孔微量细胞板上用MDCK病变法进行TC ID50测定。各稀释度接种10,每孔接种0. 1 mL,接种方法同病毒分离, 3335 、5% CO2一周判读TCID50结果。A /江苏北塘/122 /2008 (H1)106. 2 TC ID50 /0. 1 mL、A /江苏北塘/149 /2008 ( H3 ) 106. 5TCID50 /0. 1 mL、B /江苏北塘/137 /2008 106. 5TCID50 /0. 1 mL。

6. mRT2PCR、胶体金法敏感性试验 采用mRT2PCR、胶体金法分别对上述各型病毒105、104、103、102、101 TCID50 /0. 1 mL进行3次敏感性检测实验。

三、统计学方法

使用SPSS 11. 0 统计软件进行分析,组间比较采用χ检验。

结  果

一、mRT2PCR与胶体金法检测结果

mRT2PCR和胶体金法检测经传统细胞培养、HI鉴定已知A型流感病毒阳性的2008年鼻咽标本58,已知型流感病毒阳性鼻咽拭标本20;已知流感病毒阴性鼻咽拭标本40份。见表1。mRT2PCRA型流感病毒检测敏感性为是44.8% (26 /58) ,特异性为97. 5% ( 39 /40) ;B型流感病毒检测敏感性为20. 0% (4 /20) ,特异性为100. 0% (40 /40) 。胶体金法对A型流感病毒检测敏感性为44. 8% ( 26 /58 ) ,特异性为100. 0% (0 /40) ;型流感病毒检测敏感性为5. 0% ( 1 /20) ,特异性为97. 5% ( 39 /40) 。mRT2PCR和胶体金法对A、型流感病毒阳性检出率差异无统计学意义( P = 0. 872 5、0. 679 4) 。对经MDCK细胞分离培养阳性的A /H1、A /H33型流感培养液,mRT2PCR和胶体金法检测的阳性符合率、型别符合率均为100. 0% mRT2PCR亚型符合率为100. 0%。见图1。

  注:MMarker; 1A /江苏北塘/110 /2007 (H1) 、2A /江苏北塘/112 /2007 (H1 ) 、A /江苏北塘/122 /2008 (H1 ) 、A /江苏北塘/1209 /2008 ( H1 ) ; 5 A /江苏北塘/1266 /2007(H3) 、6A /江苏北塘/1272 /2007 (H3) 、A /江苏崇安/26 /2008 (H3) 、8A /江苏北塘/1160 /2008 (H3) ; 9B /江苏南长/1351 /2007、10B /江苏南长/126 /2008、11B /江苏南长/199 /2008; 12H1、H3、B型流感病毒阳性标本mRT2PCR对照; 13H1 +H3引物对已知型流感病毒检测对照、14 H1 + B 引物对已知H3型流感病毒检测对照、15H3 +B引物对已知H1型流感病毒检测对照

1 病毒培养阳性细胞培养液mRT2PCR检测结果

二、mRT2PCR、胶体金法检测敏感性试验结果

对已稀释成101 105 TC ID50 /0. 1 mL 的已知A /江苏北塘/122 /2008 (H1 ) 、A /江苏北塘/149 /2008 (H3) 、B /江苏北塘/137 /2008流感病毒分离阳性标本进行mRT2PCR、胶体金法检测敏感性试验。结果mRT2PCR的敏感性为103 TC ID50 /0. 1 mL, 见图2。胶体金法也为103 TC ID50 /0. 1 mL,3次结果相同。 注: MMarker; 1105 TCID50 /0. 1 mL H1、H3、B; 2104TCID50 /0. 1 mL H1、H3、B; 3103 TCID50 /0. 1 mL H1、H3、B; 4102 TCID50 /0. 1 mL H1、H3、B; 5 101 TCID50 /0. 1 mL H1、H3、B; 6为阳性对照; 7 H1 + H3 引物对已知型流感病毒检测对照; 8 H1 +B 引物对已知H3型流感病毒检测对照; 9 H3 +B引物对已知H1型流感病毒检测对照

2 mRT2PCR的敏感性结果

讨  论

以传统流感病毒分离培养和H I鉴定方法为标准,mRT2PCR和胶体金法对经MDCK细胞培养的阳性培养液进行检测, 2种方法的阳性检出率和A、B型符合率均为100. 0%。mRT2PCR H1 +H3引物对已知型流感病毒检测、H1 +B 引物对已知H3型流感病毒检测、H3 +B引物对已知H1型流感病毒检测对照均为阴性,说明本实验所用的流感病毒H1、H3BmRT2PCR引物具有很好的特异性。对经传统流感病毒分离培养和H I鉴定为A型流感病毒58份咽拭标本、型流感病毒20份咽拭标本,mRT2PCRA型流感病毒的检测敏感性为44. 8% ,型流感病毒的检测敏感性为20. 0%。这可能与部分标本在70 冰箱储存一段时间以后再进行核酸抽提mRT2PCR 有关,如果是新鲜咽拭标本提取核酸进行mRT2PCR检测,阳性检出率会增高,对于需要快速知道结果的人群聚集性流感, mRT2PCR 检测是可取的方法,因为传统的病毒分离培养和H I鉴定耗费时间较长。虽然胶体金法出结果快速,只需20 min,操作简便,适于现场检测,但其只能鉴定A型流感,目前还不能进行亚型鉴定,并且没有国产试剂,试剂盒价格昂贵,有文献报道敏感性相对较低[ 2 ] 。mR2PCR 检测需4 h,需要一定的仪器设备,比胶体金法成本低,并且可以进行亚型鉴定。对于聚集性流感暴发,首先要快速出结果,并且最好能够提供型与亚型的诊断。

本研究结果显示,mRT2PCR和胶体金法的病毒检出敏感性均为103 TCID50 /0. 1 mL, VanElden[ 5 ]报道的结果基本相同。而在对疑似流感患者鼻咽拭子标本进行病毒分离时发现90%左右的标本在接种细胞后34 d出现细胞病变,说明大部分鼻咽拭子标本中病毒含量在101 102 TCID50 /0. 1 mL左右[ 6 ] 。用PCRcDNA进行检测的敏感性可达0. 020. 1 TCID50 /0. 1 mL[7 ] ,其检测的敏感性不容置疑,但由于流感病毒为RN病毒,还涉及病毒RNA抽提过程中的损失以及如果标本不是立即进行逆转录至cDNA,可能存在病毒RNA降解等问题,因此我们准备进一步对鼻咽拭标本经MDCK细胞培养818 h后采用mRT2PCR鉴定和其他方法的研究,克服传统培养分离和H I鉴定需要时间较长、需要流感病毒型特异性抗血清和PCR反应体系所需要的有效模板数问题,以提高检测的敏感性。

参考文献

[ 1 ]  郭元吉,程小雯流行性感冒病毒及其实验技术[M ]. 北京:中国三峡出版社, 1997: 138.

[ 2 ]  Bucher DJ,Mikhail A, Popp le S, et al. Rap id detectionof type A influenza viruseswith monoclonal antibodies tothe M p rotein (Ml) by enzyme2linked immunosorbent assay and time2resolved fluoroimmunoassay[ J ]. J ClinMicrobio, 1991, 11 (5) : 248422488.

[ 3 ]  Park SY, Shimizu H, Adachi S, et al. Crystal structureof nitric oxide reductase from denitrifying fungusFusarium oxysporum [ J ]. Nat Struct Biol, 1997, 4(10) : 8272832.

[ 4 ]  Yamada A, Lam L, Tam JS. Typ ing and subtyp ing ofinfluenza viruses and resp iratory syncytial viruses bymultip lex RT2PCR [ J ]. Int Congr Ser, 2004, 12(63) : 3812385.

[ 5 ]  Van Elden LJ,NijhuisM, Schipper P, et al. Simultaneousdetection of influenza viruses A and B using real2timequantitative PCR[ J ]. J ClinMicrobiol, 2001, 1 (39) :1962200.

[ 6 ]  耿贯一流行病学[M ]. 北京:人民卫生出版社,1984: 35240.

[ 7 ]  姚 栩张彩云陈智伟,应用PCR 2RFLP技术进行乙型流感病毒鉴别的实验研究[ J ]. 中国卫生检验杂志, 2007, 17 (11) : 194821951.